Экспериментальное исследование индукции гуморального ответа на синтетический мультимерный пептидный антиген, потенциально имитирующий конформационный эпитоп нейтрализации ВИЧ-1

Аннотация

Цель исследования. Цель - исследование возможности получения антител против линейного синтетического пептида, состоящего из повторов 3-хаминокислотного эпитопа, потенциально имитирующего конформацтонный эпитоп нейтрализации ВИЧ-1 – NEQ (аспарагин, глутамин, глутамат). Наша авторская идея состояла в мультипликации такого 3-х аминокислотного эпитопа в 15-ти аминокислотном линейном синтетическом пептиде (NEQ)₅. Методика. Пептид был синтезирован в компании Biopeptide Co. (USA). Степень очистки искомого продукта составляла 95%. Для создания иммуногенного препарата данный пептид ковалентно конъюгировали с высокомолекулярным пептидогликаном растительного происхождения Иммуномаксом™ отечественного производства в качестве иммуноадъюванта. Сшивающим агентом служил реагент SMCC (сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат). Искомый продукт выделяли на колонке Zeba® Desalt Spin Columns. Полученным конъюгатом иммунизировали двухмесячных мышей-самок (CBA x C57Bl)F1. Иммунизацию производили трижды с интервалами в 30-45 сут. Все манипуляции с животными выполняли по стандартам SOP. Наличие анти-пептидных антител и их титр в сыворотках крови мышей оценивали методом ИФА. Оценивали также in vivo влияние внутрибрюшинного введения чистого адъюванта на транскрипцию информационной РНК первичного провоспалительного цитокина TNF в клетках перитонеального экссудата. Исследования проводили методом ПЦР в динамике, начиная с 30 мин до 48 ч после введения препарата. Взаимодействие полученных анти-пептидных антител с репликационно способным ВИЧ-1 оценивали в заражаемой культуре клеток МТ4 по уровню вирусного белка р24 в супернатанте. Последний измеряли в указанные сроки методом ИФА в тест-системе «Вектор бест». Результаты. Пептид в чистом виде при введении in vivo мышам не индуцировал биосинтез антител в определяемых количествах. При иммунизации мышей конъюгатом пептида с Иммуномаксом™ титры антипептидных антител составляли 10⁵⁻⁶. Иммуномакс™ сам по себе при введении in vivo индуцировал транскрипцию иРНК TNF импульсно: в одном опыте в течении шестого часа, в другом – восьмого часа, без реактивации транскрипции в более поздние сроки. При добавлении анти-пептидной сыворотки в разведении 1/10 в культуру клеток МТ4, инфицированных изолятом ВИЧ-1/IIIB, выявлена нейтрализация репликации вируса примерно на 90%. В больших разведениях эффект нейтрализации отсутствовал. Та же анти-пептидная сыворотка в отношении другого изолята ВИЧ-1/899 в культуре тех же клеток МТ4 в разведении 1/20 усиливала репликацию вируса, что было воспроизведено в 4-х повторных опытах. Реакции пептида с глутаматным рецептором мозга в ИФА тест-системе зарегистрировано не было. Заключение. Синтетический пептид – мультимер триплета (NEQ)₅, ковалентно конъюгированный с растительным пептидогликаном Иммуномакс™ в качестве адъюванта, индуцирует антительный ответ у мышей в титрах 10⁵⁻⁶ по данным ИФА. Введение мышам чистого адъюванта в той же дозе индуцирует в клетках перитонеального экссудата импульсную транскрипцию иРНК первичного провоспалительного цитокина TNF в течение 6-го или 8-го часа после введения препарата. В культуре клеток МТ4 антипептидная сыворотка в малых разведениях проявляла вирус-нейтрализующую активность в отношении изолята ВИЧ-1/IIIB, но усиливала репликацию в тех же клетках другого изолята ВИЧ-1/899. Такое расхождение результатов – нейтрализация вирусной инфекции или усиление инфекции – объясняет одну из трудностей при разработке анти-ВИЧ вакцин.